Kapalinová chromatografie je hlavní metodou pro testování obsahu každé složky a nečistot v surovinách, meziproduktech, přípravcích a obalových materiálech, ale mnoho látek nemá standardní metody, na které by se dalo spolehnout, takže je nevyhnutelné vyvinout nové metody. Při vývoji metod v kapalné fázi je jádrem kapalinové chromatografie chromatografická kolona, proto je rozhodující, jak vybrat vhodnou chromatografickou kolonu. V tomto článku autor vysvětlí, jak vybrat kolonu pro kapalinovou chromatografii ze tří hledisek: celkové nápady, úvahy a rozsah použití.
A. Celkové nápady pro výběr kolon pro kapalinovou chromatografii
1. Vyhodnoťte fyzikální a chemické vlastnosti analytu: jako je chemická struktura, rozpustnost, stabilita (například zda je snadné jej oxidovat/redukovat/hydrolyzovat), kyselost a zásaditost atd., klíčová je zejména chemická struktura faktor při určování vlastností, jako je například konjugovaná skupina má silnou ultrafialovou absorpci a silnou fluorescenci;
2. Určete účel analýzy: zda je vyžadována vysoká separace, vysoká účinnost kolony, krátká doba analýzy, vysoká citlivost, odolnost vůči vysokému tlaku, dlouhá životnost kolony, nízké náklady atd.;
- Vyberte si vhodnou chromatografickou kolonu: pochopte složení, fyzikální a chemické vlastnosti chromatografického plniva, jako je velikost částic, velikost pórů, teplotní tolerance, pH tolerance, adsorpce analytu atd.
- Úvahy pro výběr kolon pro kapalinovou chromatografii
Tato kapitola pojednává o faktorech, které je třeba vzít v úvahu při výběru chromatografické kolony z hlediska fyzikálních a chemických vlastností samotné chromatografické kolony. 2.1 Výplňová matrice
2.1.1 Matrice silikagelu Matricí výplně většiny kolon pro kapalinovou chromatografii je silikagel. Tento typ plniva má vysokou čistotu, nízkou cenu, vysokou mechanickou pevnost a snadno se modifikují skupiny (jako je fenylová vazba, aminová vazba, kyano vazba atd.), ale hodnota pH a teplotní rozsah, který toleruje, jsou omezené: Rozsah pH většiny silikagelových matricových plniv je 2 až 8, ale rozsah pH speciálně upravených fází vázaných silikagelem může být až 1,5 až 10 a existují také speciálně upravené fáze vázané silikagelem, které jsou stabilní při nízkém pH, jako je Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, který je stabilní při pH 1 až 8; horní teplotní limit silikagelové matrice je obvykle 60 ℃ a některé chromatografické kolony mohou tolerovat teplotu 40 ℃ při vysokém pH.
2.1.2 Polymerní matrice Polymerní plniva jsou většinou polystyren-divinylbenzen nebo polymethakrylát. Jejich výhodou je, že snesou široký rozsah pH – lze je použít v rozmezí 1 až 14 a jsou odolnější vůči vysokým teplotám (mohou dosahovat i nad 80 °C). Ve srovnání s plnidly C18 na bázi oxidu křemičitého má tento typ plniva silnější hydrofobnost a makroporézní polymer je velmi účinný při separaci vzorků, jako jsou proteiny. Jeho nevýhodou je, že účinnost kolony je nižší a mechanická pevnost je slabší než u plniv na bázi oxidu křemičitého. 2.2 Tvar částice
Většina moderních HPLC plniv jsou kulovité částice, ale někdy jsou to nepravidelné částice. Sférické částice mohou zajistit nižší tlak v koloně, vyšší účinnost kolony, stabilitu a delší životnost; při použití vysoce viskózních mobilních fází (jako je kyselina fosforečná) nebo když je roztok vzorku viskózní, mají nepravidelné částice větší specifický povrch, což více přispívá k plnému působení dvou fází, a cena je relativně nízká. 2.3 Velikost částic
Čím menší je velikost částic, tím vyšší je účinnost kolony a vyšší separace, ale horší odolnost vůči vysokému tlaku. Nejčastěji používanou kolonou je kolona o velikosti částic 5 μm; pokud je požadavek na separaci vysoký, lze zvolit plnivo 1,5-3 μm, což přispívá k vyřešení problému separace některých složitých matricových a vícesložkových vzorků. UPLC může používat plniva 1,5 μm; Pro semipreparativní nebo preparativní kolony se často používají plniva o velikosti částic 10 μm nebo větší. 2.4 Obsah uhlíku
Obsah uhlíku označuje podíl vázané fáze na povrchu silikagelu, který souvisí se měrným povrchem a pokrytím vázanou fází. Vysoký obsah uhlíku poskytuje vysokou kapacitu kolony a vysoké rozlišení a často se používá pro složité vzorky vyžadující vysokou separaci, ale kvůli dlouhé době interakce mezi dvěma fázemi je doba analýzy dlouhá; chromatografické kolony s nízkým obsahem uhlíku mají kratší dobu analýzy a mohou vykazovat různé selektivity a často se používají pro jednoduché vzorky, které vyžadují rychlou analýzu, a vzorky, které vyžadují podmínky vysoké vodné fáze. Obecně se obsah uhlíku C18 pohybuje od 7 % do 19 %. 2.5 Velikost pórů a specifický povrch
Adsorpční média HPLC jsou porézní částice a většina interakcí se odehrává v pórech. Proto musí molekuly vstoupit do pórů, aby byly adsorbovány a odděleny.
Velikost pórů a specifický povrch jsou dva vzájemně se doplňující pojmy. Malá velikost pórů znamená velký specifický povrch a naopak. Velký specifický povrch může zvýšit interakci mezi molekulami vzorku a navázanými fázemi, zlepšit retenci, zvýšit náplň vzorku a kapacitu kolony a separaci komplexních složek. Plně porézní plniva patří k tomuto typu plniv. Pro ty, kteří mají vysoké požadavky na separaci, se doporučuje zvolit plniva s velkým specifickým povrchem; malý specifický povrch může snížit zpětný tlak, zlepšit účinnost kolony a zkrátit dobu rovnováhy, což je vhodné pro gradientovou analýzu. K tomuto typu plniv patří plniva jádra a obalu. Za předpokladu zajištění separace se doporučuje volit plniva s malým specifickým povrchem pro ty s vysokými požadavky na účinnost analýzy. 2.6 Objem pórů a mechanická pevnost
Objem pórů, také známý jako „objem pórů“, označuje velikost prázdného objemu na jednotku částice. Může dobře odrážet mechanickou pevnost plniva. Mechanická pevnost plniv s velkým objemem pórů je o něco slabší než u plniv s malým objemem pórů. Plniva s objemem pórů menším nebo rovným 1,5 ml/g se většinou používají pro HPLC separaci, zatímco plniva s objemem pórů větším než 1,5 ml/g se používají hlavně pro molekulární vylučovací chromatografii a nízkotlakou chromatografii. 2.7 Míra omezení
Capping může snížit tailingové píky způsobené interakcí mezi sloučeninami a exponovanými silanolovými skupinami (jako je iontová vazba mezi alkalickými sloučeninami a silanolovými skupinami, van der Waalsovy síly a vodíkové vazby mezi kyselými sloučeninami a silanolovými skupinami), čímž se zlepší účinnost kolony a tvar píku . Uzavřené vázané fáze budou produkovat různé selektivity vzhledem k uzavřeným vázaným fázím, zejména u polárních vzorků.
- Rozsah použití různých kolon pro kapalinovou chromatografii
Tato kapitola popíše rozsah použití různých typů kolon pro kapalinovou chromatografii prostřednictvím některých případů.
3.1 C18 chromatografická kolona s reverzní fází
Kolona C18 je nejběžněji používaná kolona s reverzní fází, která vyhovuje testům obsahu a nečistot většiny organických látek a je použitelná pro středně polární, slabě polární a nepolární látky. Typ a specifikace chromatografické kolony C18 by měly být vybrány podle specifických požadavků na separaci. Například pro látky s vysokými požadavky na separaci se často používají specifikace 5 μm*4,6 mm*250 mm; pro látky se složitými separačními matricemi a podobnou polaritou lze použít specifikace 4 μm*4,6 mm*250 mm nebo menší velikosti částic. Autor například použil kolonu 3 μm*4,6 mm*250 mm k detekci dvou genotoxických nečistot v celecoxibu API. Oddělení těchto dvou látek může dosáhnout 2,9, což je vynikající. Navíc, za předpokladu zajištění separace, je-li požadována rychlá analýza, je často zvolena krátká kolona 10 mm nebo 15 mm. Například, když autor použil LC-MS/MS k detekci genotoxické nečistoty v piperachin fosfátové API, byla použita kolona 3 μm*2,1 mm*100 mm. Separace mezi nečistotou a hlavní složkou byla 2,0 a detekce vzorku může být dokončena za 5 minut. 3.2 Fenylový sloupec s reverzní fází
Fenylová kolona je také typem kolony s reverzní fází. Tento typ kolony má silnou selektivitu pro aromatické sloučeniny. Pokud je odezva aromatických sloučenin měřená běžnou C18 kolonou slabá, můžete zvážit výměnu fenylové kolony. Když jsem například vyráběl celecoxib API, odezva hlavní složky měřená fenylovou kolonou stejného výrobce a stejné specifikace (všechny 5 μm*4,6 mm*250 mm) byla asi 7krát větší než u kolony C18. 3.3 Kolona normální fáze
Jako účinný doplněk ke koloně s reverzní fází je kolona s normální fází vhodná pro vysoce polární sloučeniny. Pokud je pík stále velmi rychlý při eluci s více než 90% vodnou fází v koloně s reverzní fází a dokonce se blíží píku rozpouštědla a překrývá se s ním, můžete zvážit výměnu kolony s normální fází. Tento typ kolony zahrnuje hilic kolonu, amino kolonu, kyano kolonu atd.
3.3.1 Hilic kolona Hilic kolona obvykle obsahuje hydrofilní skupiny ve vázaném alkylovém řetězci, aby se zvýšila odezva na polární látky. Tento typ kolony je vhodný pro analýzu cukerných látek. Autor použil tento typ kolony při stanovení obsahu a příbuzných látek xylózy a jejích derivátů. Izomery derivátu xylózy mohou být také dobře separovány;
3.3.2 Amino kolona a kyano kolona Amino kolona a kyano kolona odkazují na zavedení amino a kyano modifikací na konci vázaného alkylového řetězce, aby se zlepšila selektivita pro speciální látky: například amino kolona je dobrá volba pro separaci cukrů, aminokyselin, zásad a amidů; kyano kolona má lepší selektivitu při separaci hydrogenovaných a nehydrogenovaných strukturně podobných látek díky přítomnosti konjugovaných vazeb. Amino kolonu a kyano kolonu lze často přepínat mezi kolonou s normální fází a kolonou s reverzní fází, ale časté přepínání se nedoporučuje. 3.4 Chirální kolona
Chirální kolona, jak již název napovídá, je vhodná pro separaci a analýzu chirálních sloučenin, zejména v oblasti léčiv. Tento typ kolony může být zvažován, když konvenční kolony s reverzní fází a normální fází nemohou dosáhnout separace izomerů. Autor například použil chirální kolonu 5 μm*4,6 mm*250 mm k oddělení dvou izomerů 1,2-difenylethylendiaminu: (1S, 2S)-1,2-difenylethylendiaminu a (1R, 2R)-1, 2 -difenylethylendiamin a separace mezi těmito dvěma dosáhla asi 2,0. Chirální kolony jsou však dražší než jiné typy kolon, obvykle 1W+/kus. Pokud jsou takové sloupce potřeba, jednotka musí vytvořit dostatečný rozpočet. 3.5 Iontoměničová kolona
Iontoměničové kolony jsou vhodné pro separaci a analýzu nabitých iontů, jako jsou ionty, proteiny, nukleové kyseliny a některé cukerné látky. Podle typu plniva se dělí na katexové kolony, aniontoměničové kolony a silné katexové kolony.
Mezi katexové kolony patří kolony na bázi vápníku a vodíku, které jsou vhodné především pro analýzu kationtových látek, jako jsou aminokyseliny. Autor například použil kolony na bázi vápníku při analýze glukonátu vápenatého a octanu vápenatého v proplachovacím roztoku. Obě látky měly silné odezvy při λ=210 nm a stupeň separace dosáhl 3,0; autor použil při analýze látek souvisejících s glukózou kolony na bázi vodíku. Několik hlavních příbuzných látek – maltóza, maltotrióza a fruktóza – mělo vysokou citlivost pod diferenciálními detektory, s detekčním limitem jen 0,5 ppm a stupněm separace 2,0-2,5.
Aniontoměničové kolony jsou vhodné především pro analýzu aniontových látek, jako jsou organické kyseliny a halogenové ionty; silné kationtoměničové kolony mají vyšší iontoměničovou kapacitu a selektivitu a jsou vhodné pro separaci a analýzu komplexních vzorků.
Výše uvedené je pouze úvodem do typů a rozsahů použití několika běžných kolon pro kapalinovou chromatografii v kombinaci s vlastními zkušenostmi autora. Ve skutečných aplikacích existují další speciální typy chromatografických kolon, jako jsou chromatografické kolony s velkými póry, chromatografické kolony s malými póry, kolony pro afinitní chromatografii, multimodové chromatografické kolony, kolony pro ultravysokou kapalinovou chromatografii (UHPLC), kolony pro superkritickou tekutinovou chromatografii ( SFC) atd. Hrají důležitou roli v různých oblastech. Konkrétní typ chromatografické kolony by měl být vybrán podle struktury a vlastností vzorku, požadavků na separaci a dalších účelů.
Čas odeslání: 14. června 2024