chromatografie, také známá jako "chromatografická analýza", "chromatografie", je separační a analytická metoda, která má velmi široké uplatnění v analytické chemii, organické chemii, biochemii a dalších oborech.
Zakladatelem chromatografie je ruský botanik M. Tsvetter.V roce 1906 zveřejnil ruský botanik Zvetter výsledky svého experimentu: Aby oddělil rostlinné pigmenty, nalil petroletherový extrakt obsahující rostlinné pigmenty do skleněné zkumavky obsahující prášek uhličitanu vápenatého a eluoval petroletherem odshora dolů.Protože různé pigmenty mají různou adsorpční kapacitu na povrchu částic uhličitanu vápenatého, s procesem louhování se různé pigmenty pohybují dolů různou rychlostí a vytvářejí tak pásy různých barev.Pigmentové složky byly odděleny.Tuto separační metodu nazval chromatografie.
Schematické znázornění experimentu separace pigmentu z listů rostlin
S neustálým rozvojem separačních metod se předmětem separace stává stále více bezbarvých látek, chromatografie také postupně ztratila význam „barva“, ale název se používá dodnes.
Chromatografická klasifikace
Podstatou chromatografie je proces, při kterém se molekuly, které mají být separovány, rozdělí a vyváží mezi stacionární fázi a mobilní fázi.Různé látky jsou rozděleny mezi dvě fáze odlišně, což způsobuje, že se pohybují různou rychlostí s mobilní fází.Pohybem mobilní fáze se na stacionární fázi od sebe oddělují různé složky směsi.V závislosti na mechanismu jej lze rozdělit do různých kategorií.
1, podle dvoufázové klasifikace fyzikálního stavu
Mobilní fáze: Plynová chromatografie, kapalinová chromatografie, superkritická kapalinová chromatografie
Stacionární fáze: plyn-pevná látka, plyn-kapalina;Kapalina-pevná, kapalina-kapalina
2, podle formy klasifikace stacionární fáze
Sloupcová chromatografie: sloupcová chromatografie, kapilární sloupcová chromatografie, mikrobalová kolonová chromatografie, preparativní chromatografie
Rovinná chromatografie: papírová chromatografie, chromatografie na tenké vrstvě, polymerní membránová chromatografie
3, klasifikované podle separačního mechanismu
Adsorpční chromatografie: Různé složky jsou separovány podle jejich adsorpční a desorpční kapacity na adsorbentech
Rozdělovací chromatografie: Různé složky se oddělí podle jejich rozpustnosti v rozpouštědle
Molekulární vylučovací chromatografie: podle velikosti molekulové velikosti separace ln iontoměničová chromatografie: různé složky afinity k separaci iontoměničové pryskyřice
Afinitní chromatografie: Separace pomocí přítomnosti specifické afinity mezi biologickými makromolekulami
Kapilární elektroforéza: složky byly separovány podle rozdílů v pohyblivosti a/nebo rozdělovacím chování
Chirální chromatografie se používá pro separaci a analýzu chirálních léčiv, které lze rozdělit do tří kategorií: metoda chirální derivatizace;Chirální aditivní metoda mobilní fáze;Chirální metoda stacionárního fázového rozlišení
Základní terminologie pro chromatografii
Křivky získané vynesením signálů odezvy složek po detekci chromatografické separace proti času se nazývají chromatogramy.
základní linie:Za určitých chromatografických podmínek se křivka signálu generovaného při průchodu pouze mobilní fáze systémem detektoru nazývá základní linie, jak je znázorněno na linii ot.Když byly experimentální podmínky stabilní, základní linií byla přímka rovnoběžná s horizontální osou.Základní čára odráží šum přístroje, hlavně detektoru, v průběhu času.
Výška píku:vertikální vzdálenost mezi bodem chromatografického píku a základní linií, označená h, jak je znázorněno na linii AB'.
Šířka regionu:Šířka oblasti chromatografického píku přímo souvisí s účinností separace.K popisu šířky chromatografického píku existují tři metody: standardní odchylka σ, šířka píku W a FWHM W1/2.
Směrodatná odchylka (σ):σ je poloviční vzdálenost mezi dvěma inflexními body na křivce normálního rozdělení a hodnota σ udává stupeň disperze složek směrem od sloupce.Čím větší je hodnota σ, tím více dispergované složky odpadních vod a tím horší separační efekt.Naopak odtokové složky jsou koncentrované a separační efekt je dobrý.
Šířka píku W:Průsečíky na obou stranách chromatografického píku se používají jako tečné čáry a průsečík na základní čáře se nazývá šířka píku nebo šířka základní čáry, kterou lze také vyjádřit jako W, jak je znázorněno na obrázku IJ.Podle principu normálního rozdělení lze prokázat vztah mezi šířkou píku a směrodatnou odchylkou W=4σ.
W1/2:Šířka píku v polovině výšky píku se nazývá FWHM, jak je znázorněno pro vzdálenost GH.W1/2 = 2,355 σ, W = 1,699 W1/2.
W1/2, W jsou oba odvozeny z σ a používají se k výpočtu ploch píků navíc k měření efektu kolony.Měření FWHM je pohodlnější a nejčastěji používané.
stručné shrnutí
Z chromatografické křivky odtoku píku lze dosáhnout následujících cílů:
a, Kvalitativní analýza byla provedena na základě retenční hodnoty chromatografických píku
b, kvantitativní analýza založená na ploše nebo píku chromatografického píku
C. Separační účinnost kolony byla hodnocena podle retenční hodnoty a šířky píku chromatografického píku
Výpočtový vzorec používaný v chromatografii
1. Retenční hodnota
Retenční hodnota je parametr používaný k popisu stupně, do kterého je složka vzorku zadržena v koloně a používá se jako indikátor chromatografické charakterizace.Způsob jeho reprezentace je následující:
Doba uchování tR
Čas smrtitM
Upravte retenční čas tR'=tR-tM
(Celkový čas strávený ve stacionární fázi)
Objem retence
VR=tR*F. (nezávislé na rychlosti mobilní fáze)
Mrtvý objem
VM=tM*Fc
(Prostor, který nezabírá stacionární fáze v průtokové cestě od injektoru k detektoru)
Upravte retenční objem VR'=t'R*Fc
2. Relativní retenční hodnota
Relativní retenční hodnota, také známá jako separační faktor, poměr rozdělovacích koeficientů nebo relativní kapacitní faktor, je poměr upraveného retenčního času (objemu) testované složky k upravenému retenčnímu času (objemu) standardu za určitých chromatografických podmínek.
Relativní retenční hodnoty byly použity k eliminaci vlivu určitých provozních podmínek, jako je průtok a fixační ztráta, na retenční hodnoty.Standardem v relativní retenční hodnotě může být složka v testovaném vzorku nebo sloučenina přidaná uměle.
3. Index retence
Retenční index je retenční index látky i, která má být testována ve fixním roztoku X. Jako referenční látky jsou vybrány dva n-alany, z nichž jeden má počet uhlíků N a druhý má N+n.Jejich upravený retenční čas je t'r (N) respektive t'r (N+n), takže upravený retenční čas t'r (i) testované látky i leží přesně mezi nimi, tj. t'r (N).
Retenční index lze vypočítat následovně.
4. Faktor kapacity (k)
V rovnováze poměr hmotnosti složky ve stacionární fázi (s) k mobilní fázi (m), nazývaný kapacitní faktor.Vzorec je následující:
5、Rozdělovací koeficient (K) V rovnováze poměr koncentrace složky ve stacionární fázi (s) k mobilní fázi (m), nazývaný rozdělovací koeficient.Vzorec je následující
Vztah mezi K a k:
Odráží typ sloupu a jeho uzel důležité vlastnosti struktury
stručné shrnutí
Vztah mezi retenční hodnotou a kapacitním faktorem a rozdělovacím koeficientem:
Chromatografická separace je založena na rozdílu v adsorpční nebo rozpouštěcí schopnosti každé složky ve fixním relativním vzorku, který lze kvantitativně vyjádřit velikostí hodnoty rozdělovacího koeficientu K (nebo kapacitního faktoru k).
Složky se silnou adsorpční nebo rozpouštěcí schopností mají velký rozdělovací koeficient (nebo kapacitní faktor) a dlouhou retenční dobu.Naopak složky se slabou adsorpcí nebo rozpustností mají malý rozdělovací koeficient a krátký retenční čas.
Základní teorie chromatografie
1. Teorie podnosů
(1) Předloženo -- termodynamická teorie
Začalo to modelem věžové desky, který navrhli Martin a Synge.
Frakcionační kolona: na patro pro několikanásobné dosažení rovnováhy plyn-kapalina, podle bodu varu různé separace.
Sloupec: Složky jsou vyváženy několika přepážkami mezi dvěma fázemi a odděleny podle různých rozdělovacích koeficientů.
(2) Hypotéza
(1) V koloně je mnoho pater a složky mohou rychle dosáhnout distribuční rovnováhy v intervalu pater (tj. výšky patra).
(2) Mobilní fáze vstupuje do kolony ne kontinuálně, ale pulzuje, to znamená, že každý průchod je objem kolony.
(3) Když byl vzorek přidán na každou desku kolony, difúze vzorku podél osy kolony mohla být zanedbaná.
(4) Rozdělovací koeficient je stejný na všech podnosech, nezávisle na množství složek.To znamená, že rozdělovací koeficient je na každém tabanu konstantní.
(3) Princip
Schematické schéma teorie zásobníků
Pokud se do podnosu č. 0 přidá složka jednotkové hmotnosti, totiž m=1 (například 1mg nebo 1μg), a po distribuční rovnováze, protože k=1, totiž ns=nm, nm=ns=0,5.
Když objem desky (lΔV) nosného plynu vstoupí do desky 0 ve formě pulsace, nosný plyn obsahující složku nm v plynné fázi je vytlačen na desku 1. V tomto okamžiku složka ns v kapalné fázi desky 0 a nm složka v plynné fázi desky 1 bude redistribuována mezi dvě fáze.Celkové množství složek obsažených v desce 0 je tedy 0,5, přičemž plynná a kapalná fáze jsou každá 0,25, a celkové množství obsažené v desce 1 je také 0,5.Plynná a kapalná fáze byly také 0,25.
Tento proces se opakuje pokaždé, když do kolony pulzuje nový objem nosného plynu (viz tabulka níže).
(4) Rovnice chromatografické odtokové křivky
σ je standardní odchylka, je retenční čas, C je koncentrace v libovolném čase,
C, je injekční koncentrace, tj. celkové množství složek (plocha vrcholu A).
(5) parametry účinnosti kolony
Při konstantní tR, čím menší W nebo w 1/2 (tj. užší pík), tím větší je počet teoretických pater n, tím menší je teoretická výška pater a tím vyšší je separační účinnost kolony.Totéž platí o efektivní teorii zásobník neff.Teoretický počet pater je proto indexem pro hodnocení účinnosti kolon.
(5) Charakteristiky a nedostatky
> Výhody
Teorie tácu je semiempirická a vysvětluje tvar odtokové křivky
Jsou znázorněny procesy rozdělování a separace složek
Je navržen index pro hodnocení účinnosti kolony
> Omezení
Komponenty nemohou skutečně dosáhnout distribuční rovnováhy ve dvou fázích:
Podélnou difúzi složek ve sloupci nelze ignorovat:
Vliv různých kinetických faktorů na proces přenosu hmoty nebyl uvažován.
Vztah mezi sloupcovým efektem a rychlostí proudění mobilní fáze nelze vysvětlit:
Není jasné, jaké hlavní faktory ovlivňují sloupcový efekt
Tyto problémy jsou uspokojivě vyřešeny v teorii sazeb.
2. Teorie sazeb
V roce 1956 holandský vědec VanDeemter et al.absorboval koncept teorie patra a spojil kinetické faktory ovlivňující výšku patra, předložil kinetickou teorii chromatografického procesu - teorii rychlosti a odvodil VanDeemterovu rovnici.Chromatografický proces považuje za dynamický nerovnovážný proces a studuje vliv kinetických faktorů na rozšíření píku (tj. sloupcový efekt).
Později Giddings a Snyder a kol.navrhl rovnici rychlosti kapalinové chromatografie (jmenovitě Giddingsovu rovnici) založenou na VanDeemterově rovnici (později nazývané rychlostní rovnice plynové chromatografie) a podle rozdílu vlastností mezi kapalinou a plynem.
(1) Van Deemterova rovnice
Kde: H: je výška desky
A: koeficient členu vířivé difúze
B: koeficient členu molekulové difúze
C: koeficient členu odporu přenosu hmoty
(2) Giddingsova rovnice
Kvantitativní a kvalitativní analýza
(1) Kvalitativní analýza
Kvalitativní chromatografická analýza má určit sloučeniny reprezentované každým chromatografickým píkem.Protože různé látky mají za určitých chromatografických podmínek určité retenční hodnoty, lze retenční hodnotu použít jako kvalitativní index.Na retenčních hodnotách jsou v současnosti založeny různé chromatografické kvalitativní metody.
Různé látky však mohou mít podobné nebo stejné retenční hodnoty za stejných chromatografických podmínek, to znamená, že retenční hodnoty se nevylučují.Je tedy obtížné charakterizovat zcela neznámý vzorek pouze na základě retenčních hodnot.Pokud lze na základě pochopení zdroje, povahy a účelu vzorku provést předběžné posouzení složení vzorku a ke stanovení sloučeniny reprezentované chromatografickým píkem lze použít následující metody.
1. Kvalitativní kontrola pomocí čistých látek
Za určitých chromatografických podmínek má neznámá pouze definovaný retenční čas.Neznámou lze tedy kvalitativně identifikovat porovnáním retenčního času známé čisté látky za stejných chromatografických podmínek s retenčním časem neznámé látky.Pokud jsou tyto dva stejné, neznámá látka může být známá čistá látka;Jinak neznámé není čistou substancí.
Metoda kontroly čisté látky je použitelná pouze pro neznámou látku, jejíž složení je známé, jejíž složení je relativně jednoduché a jejíž čistá látka je známá.
2. Metoda relativní retenční hodnoty
Relativní retenční hodnota α se vztahuje k úpravě mezi složkou i a referenčními materiály. Poměr retenčních hodnot:
Mění se pouze změnou teploty fixativa a kolony a nemá nic společného s jinými provozními podmínkami.
Při určité stacionární fázi a teplotě kolony se měří upravené retenční hodnoty složky i a referenční látky s a poté se vypočítají podle výše uvedeného vzorce.Získané relativní retenční hodnoty lze kvalitativně porovnat s odpovídajícími hodnotami v literatuře.
3, přidáním známých látek pro zvýšení metody výšky píku
Pokud je v neznámém vzorku mnoho složek, získané chromatografické píky jsou příliš husté na to, aby je bylo možné snadno identifikovat výše uvedenou metodou, nebo když je neznámý vzorek použit pouze pro analýzu specifikované položky.
"Nejprve se udělá chromatogram neznámého vzorku a poté se získá další chromatogram přidáním známé látky k neznámému vzorku."Pro takové látky mohou být známé komponenty se zvýšenou výškou píku.
4. Zachovat kvalitativní metodu indexu
Retenční index představuje retenční chování látek na fixativech a je v současnosti nejpoužívanějším a mezinárodně uznávaným kvalitativním indexem v GC.Má výhody dobré reprodukovatelnosti, jednotného standardu a malého teplotního koeficientu.
Retenční index souvisí pouze s vlastnostmi stacionární fáze a teplotou kolony, nikoli však s jinými experimentálními podmínkami.Jeho přesnost a reprodukovatelnost jsou vynikající.Pokud je teplota kolony stejná jako teplota stacionární fáze, lze pro identifikaci použít hodnoty z literatury a není nutné používat čistý materiál pro srovnání.
(2)Kvantitativní analýza
Základ pro chromatografickou kvantifikaci:
Úkolem kvantitativní analýzy je najít sto složek ve smíšeném vzorku
Zlomkový obsah.Chromatografická kvantifikace byla založena na následujícím: když byly provozní podmínky konzistentní, bylo
Hmotnost (nebo koncentrace) měřené složky je určena signálem odezvy vydaným detektorem
Je to úměrné.A to:
Základ pro chromatografickou kvantifikaci:
Úkolem kvantitativní analýzy je najít sto složek ve smíšeném vzorku
Zlomkový obsah.Chromatografická kvantifikace byla založena na následujícím: když byly provozní podmínky konzistentní, bylo
Hmotnost (nebo koncentrace) měřené složky je určena signálem odezvy vydaným detektorem
Je to úměrné.A to:
1. Metoda měření plochy píku
Plocha píku je základní kvantitativní údaj poskytovaný chromatogramy a přesnost měření plochy píku přímo ovlivňuje kvantitativní výsledky.Pro chromatografické píky s různými tvary píků byly použity různé metody měření.
Je obtížné najít přesnou hodnotu zimy v kvantitativní analýze:
Na jedné straně kvůli obtížnosti přesného měření absolutního vstřikovaného objemu: na straně druhé
Plocha píku je závislá na chromatografických podmínkách a chromatografický proužek by měl být při měření hodnoty udržován
Není možné ani vhodné dělat totéž.A i když se vám to podaří
Přesnou hodnotu také proto, že neexistuje jednotná norma a nelze ji přímo aplikovat.
2.Kvantitativní korekční faktor
Definice kvantitativního korekčního faktoru: množství složek vstupujících do detektoru (m)
Poměr jeho chromatografické plochy píku (A) nebo výšky píku () je konstanta úměrnosti (,
Konstanta úměrnosti se nazývá absolutní korekční faktor pro složku.
Je obtížné najít přesnou hodnotu zimy v kvantitativní analýze:
Na jedné straně kvůli obtížnosti přesného měření absolutního vstřikovaného objemu: na straně druhé
Plocha píku je závislá na chromatografických podmínkách a chromatografický proužek by měl být při měření hodnoty udržován
Není možné ani vhodné dělat totéž.A i když se vám to podaří
Přesnou hodnotu také proto, že neexistuje jednotná norma a nelze ji přímo aplikovat.
To znamená, že relativní korekční faktor součásti je součást a referenční materiál
Poměr absolutních korekčních faktorů.
Je vidět, že relativní korekční faktor je, když je kvalita součásti oproti standardu.
Když je látka s stejná, plocha píku referenčního materiálu je plochou píku složky
Násobek.Pokud má některá složka hmotnost ma plochu píku A, pak počet f'A
Hodnoty se rovnají ploše píku referenčního materiálu o hmotnosti.Jinými slovy,
Pomocí relativního korekčního faktoru lze oddělit oblasti píku každé složky
Přepočteno na plochu píku referenčního materiálu rovnou jeho hmotnosti, pak poměr
Norma je jednotná.Toto je tedy normalizovaná metoda, jak zjistit procento každé složky
Základ množství.
Způsob získání relativního korekčního faktoru: hodnoty relativního korekčního faktoru byly porovnány pouze s bytím
Měření se vztahuje ke standardu a typu detektoru, ale k operačnímu proužku
To je jedno.Hodnoty lze proto získat z odkazů v literatuře.Pokud text
Pokud požadovanou hodnotu v nabídce nenajdete, můžete si ji určit také sami.Způsob stanovení
Metoda: Určité množství měřené látky deset vybraných referenčních materiálů → upraveno do určité koncentrace
Byly měřeny chromatografické plochy píku A a As dvou složek.
To je vzorec.
3. Kvantitativní výpočetní metoda
(1) Metoda normalizace plochy
Součet obsahu všech frakcí bez píku byl vypočten jako 100 % pro kvantifikaci
Metoda se nazývá normalizace.Jeho výpočetní vzorec je následující:
Kde P,% je procentuální obsah testovaných složek;A1, A2... A n je složka 1. Plocha píku 1~n;f'1, f'2... f'n je relativní korekční faktor pro složky 1 až n.
(2) metoda externího standardu
Metoda kvantitativního srovnání mezi signálem odezvy složky, která má být testována ve vzorku, a čisté složky, která má být testována jako kontrola.
(3) Metoda vnitřního standardu
Metoda tzv. vnitřního standardu je metoda, při které se ke standardnímu roztoku testované látky a roztoku vzorku přidá určité množství čisté látky jako vnitřní standard a poté se analyzuje a stanoví.
(3)standardní metoda přidávání
Standardní metoda přidávání, známá také jako metoda vnitřního přidávání, spočívá v přidání určitého množství (△C)
K testovanému roztoku vzorku byla přidána reference testované látky a test byl přidán do testu
Pík roztoku vzorku po látce byl vyšší než pík původního roztoku vzorku
Přírůstek plochy (△A) byl použit k výpočtu koncentrace látky v roztoku vzorku
Obsah (Cx)
Kde Ax je plocha píku látky, která má být měřena v původním vzorku.
Čas odeslání: 27. března 2023